高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。

作為分析化學中被廣泛使用的一種技術，高效液相色譜法用于分離、鑒定和量化混合物中的成分。高效液相色譜分離的成功與否在很大程度上取決于流動相的特性，流動相是流經固定相的液體溶劑。應根據分析物的化學性質和所用固定相的性質仔細選擇流動相。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術應用。

什么是流動相？

流動相是流經高效液相色譜柱固定相的液體溶劑，攜帶著分析物。其兩個主要作用如下：

? 溶解樣品成分并將其帶入固定相；

? 與固定相相互作用，促進分析物的分離。

流動相的類型

高效液相色譜法使用的流動相可分為兩大類：

? 水性流動相(主要成分是水)

高效液相色譜分離通常使用水性流動相，因為水性流動相能有效溶解多種分析物，而且價格通常低于非水性溶劑。常見的水性流動相是水與甲醇或乙腈等有機試劑的混合物。有機改性劑的選擇取決于所分離分析物的性質和所使用的固定相。

? 非水性流動相(不含水)

當被分離的分析物不溶于水或水會干擾分離時，就會使用非水性流動相。非水性流動相包括二氯甲烷、四氫呋喃和正己烷等溶劑。這些溶劑通常與甲醇或乙腈等極性溶劑結合使用，以提高分離效率。

流動相的特性

流動相的特性對高效液相色譜分離至關重要，因為它們會大大影響分離效率和選擇性。其重要特性包括極性、粘度、pH值和離子強度。

? 極性

流動相的極性是高效液相色譜分離的關鍵因素，因為它決定了分析物與固定相之間相互作用的強度。極性流動相適用于分離極性化合物，而非極性流動相則是分離非極性化合物的理想選擇。可通過改變水性流動相中有機改性劑與水的比例來調節流動相的極性。

? 粘度

粘度是流動相的另一個關鍵屬性，因為它會影響流動相通過色譜柱所需的流速和壓力。流動相的粘度可通過改變溶劑成分、溫度或壓力來調節。

? pH

流動相的pH值在高效液相色譜分離中非常重要，因為它會影響分析物和固定相的電離狀態。流動相的pH值應根據被分離分析物和所用固定相的pKa值進行調節。如堿性流動相適合分離酸性化合物，而酸性流動相則適合分離堿性化合物。

? 離子強度

流動相的離子強度是指溶液中離子的濃度，它通過改變分析物與固定相之間的靜電相互作用來影響分離效率。流動相的離子強度可通過改變溶液中鹽或緩沖液的濃度來調節。

流動相相當于液相的血液，在使用過程中會有各種需要注意的事項。其中有些“坑”千萬要注意！

1、加入有機溶劑之后測量移動相酸堿度

如果用有機添加劑測量pH值，得到的pH值會與添加有機溶劑之前的值不同。然而最重要的一點是要保持一致。如果總是在加入有機溶劑之后測量pH值，那么務必保證在使用的方法中陳述步驟，這樣的話其他人就會按照統一方式進行。這種方式并不保證百分百準確，但至少可以保持方法的前后統一。這也許會比得到精準的pH值更加重要。

2、沒有使用緩沖液

緩沖劑的作用就是用來控制PH值并阻止其發生變化。很多其他方法會改變流動相的PH值，會引起停留時間、峰形以及峰值響應的漂移。甲酸、TFA等不是緩沖劑。

3、沒有在正常酸堿度范圍內使用緩沖液

每個緩沖鹽有兩個pH單位范圍寬度，在這個范圍內可以提供穩定性好的pH值。窗口之外的緩沖鹽不具備有效的抗pH值變化能力。要么在正確的范圍內使用緩沖劑，要么選擇一種緩沖劑可涵蓋所需pH值。

4、向有機溶液中加緩沖液

將緩沖溶液與有機相混合，很有可能會引起緩沖液沉淀。在很多情況下，即使沉淀現象已經發生了，但仍很難被發現。切記，一定要將有機溶液加入到水相當中，這可以很好的降低緩沖液沉淀的幾率。

5、從0%用泵混合濃度梯度

現在使用的泵可有效的混合流動相并實現在線脫氣，但并不是使用同一方法的任何人都會配有高質量的泵。將A和B混合到一個單獨的溶液中，在100%線上運行。如通過用50ml水混合制備有機950ml起始混合物。這樣做的好處就是可以減少HPLC之間的可變性，減少系統中產生氣泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶體的預混合保留時間也為95:5。

6、不要使用正確的改性酸(堿)改變緩沖液

只能使用形成你使用的緩沖鹽的酸或堿。如磷酸鈉緩沖液應僅用磷酸或氫氧化鈉調節。

7、沒有在方法中闡述有關緩沖液的全部信息，如在1000ml的水中加入5g磷酸鈉

緩沖劑的類型決定了能夠緩沖的PH范圍。所需的濃度決定了緩沖強度。5克或無水磷酸鈉和5克一水合物磷酸一鈉具有不同的緩沖強度。

8、還沒先檢查就開始添加有機溶劑

如果上一個方法中基線B中使用過的是緩沖液，而你的方法中，基線B使用的是有機溶液，好在你可以沉淀泵管和泵頭中的緩沖劑。

9、支起瓶體清空最后一滴

很有可能沒有足夠的流動相完成整個操作，最后樣品會冒煙的。除了可能存在燒干泵系統和柱子的可能性之外，流動相也會蒸發的一干二凈，瓶體頂部的流動相會發生變化。

10、利用超聲脫氣的流動相

最重要的一點就是確保所有的緩沖鹽已經溶解，但這是一種效果差的脫氣方式，并且它會很快讓流動相升溫，從而引起有機成分蒸發掉。為了省去之后不必要的麻煩，請用五分鐘時間使用真空過濾你的流動相。

11、選擇流動相應注意過濾溶劑

溶劑在使用前一定要用0.5pm的過濾器過濾，如果使用固體化學試劑(緩沖鹽)配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進樣器和柱頭過濾片。

12、注意保持儲液瓶的清潔

用普通溶劑瓶作流動相儲液器應不定期廢棄瓶子，最后一次應用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。

13、注意保證溶劑的質量

一定要用HPLC級的溶劑，水也應達到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。

14、注意流動相脫氣不充分

流動相受熱或流動相不同組分混合時會有氣體產生，氣泡進入泵內引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現毛刺。可試用下列方法解決問題：

(1)流動相再脫氣；

(2)采用更有效的因脫氣方法或兩種方法配合使用；

(3)改系統內混合為系統外預混合。

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。

? 系統中氣泡的產生

流動相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；

(1)氣泡的影響

存在于管路中，系統壓力不穩定，實驗結果有偏差；存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準確，甚至是不吸液存在于檢測器中，出現鬼峰，影響檢測準確性。所以做液相對流動相的氣泡和雜質要求比較嚴格。氣泡會影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。噪聲增大、基線不穩、突然跳動。

此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑(如甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。

在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中(特別是還原電化學法)，氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV因檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。

(2)常用的脫氣方法

加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。

a.氦氣脫氣

氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣，如果使用得當，在10min內可除去80%-90%的溶入氣體。由于氦氣在流動相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護的流動相可以認為是一個無氣體溶解體系。其缺點是氦氣價格比較昂貴，會增加檢驗成本。一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

b.真空脫氣

也是比較常用的脫氣方法。現在多數企業都最常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動相，在使用過程中的微量脫氣。

c.超聲波脫氣

將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時還會引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。超聲脫氣比較好，10-20分的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20-30min方可)，關于超聲時間問題眾說紛紜，各實驗室5-30分鐘不等，一般來說流動相組成為無機(緩沖鹽溶液)時，5-15分鐘即可，流動相為是水和有機容積混合時，超聲時間要相對長一些，時間的延長不和效果成正比，且其中氣泡對色譜峰基線穩定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

d.加熱回流脫氣

該法雖效果很好，但適用范圍較窄。對于有機溶劑或混合流動相不適合用此法，因為揮發性組分會損失掉，改變流動相的組成。綜合來說，用真空抽濾后，再用超聲脫氣是常用的辦法，用氦氣的方法是效果好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。

首先離線(系統外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1-4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。而在線(系統內)脫氣法無此缺點。常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

15、注意流動相供給不暢

流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩。應經常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進液管，使其不能上下移動。

過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統運轉正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需查流動相的制備過程或換大孔徑的過濾器。不管如何流動相都需要重新過濾。流速過高、阻力大，造成空化現象，這是由于過濾器孔徑、管道內徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會出現這種現象。使用以下方法解決：

? 使用低流速；

? 換大孔徑的過濾器；

? 增加進液管道內徑；

? 抬高或加壓儲液器；

? 不用過濾器，但流動相一定要先過濾；

? 儲液器蓋子太緊，在儲液器內形成真空，打出的流動相不連續。應松開蓋子或留有1mm的縫隙；

? 進液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調整進液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。

16、注意防止流動相和儲液器被污染

由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩定的濃度打入系統，而再以穩定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因為反復加進新的流動相或系統用得太久(通宵)所造成的。新加進的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報廢儲液器。流動相污染來自這幾個方面：

? 試劑質量不高，玻璃器皿不合格；

? 微生物的影響；配制流動相時操作不當等，因此要求高純度化學試劑和HPLC級溶劑。要注意玻璃器皿按規定清洗干凈；

? 為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統；

? 懷疑系統內生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統)；

? 真空脫氣時防止泵油帶入流動相；

? 用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相；

? 已經污染的流動相一定要廢棄掉。

17、注意選擇流動相應不改變填料的任何性質

低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。

18、選擇流動相應注意純度

色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。

19、選擇流動相應注意必須與檢測器匹配

使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

20、選擇流動相應注意粘度要低(應<2cp)

高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長，最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

21、選擇流動相應注意對樣品的溶解度要適宜

如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

22、選擇流動相應注意樣品易于回收

應選用揮發性溶劑。

23、選擇流動相應注意由強到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

24、選擇流動相應注意三倍規則

每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。

25、選擇流動相應注意粗調轉微調

當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。

26、流動相的配制注意有機溶劑和水性溶劑的混合方法

有機溶劑和水性溶劑的混合液作為流動相是經常的，但由于混合方法不同，有時分析結果相差很大。如20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的混合液，混合比為9：1時，20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的體積比為9：1，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當量稱取后進行混合。另外，按10%乙腈解釋，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)，將乙腈稀釋調制也可以成立。在后者情況下，產生混合體積減少部分，余下的添加20mM磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有太大的差別，但由于混合方式不同，分析結果特別是保留時間也會有大差別，這點必須注意。

27、50%或(V/V=1/1)乙腈水溶液的配制方法

對于用V/V=1/1的表示配制乙腈水溶液，多按這種方法進行：用量筒測定乙腈500mL，用另一量筒測定水500mL，兩種液體在瓶內充分搖晃混合。不過50%乙腈水溶液的表示時，同樣也多是按上述方法配制，但查化學辭典時，實際上是按這種方法進行配制：首先將500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達到室溫，用全量水，使溶液到1L。這樣一來，用%表示和“V/V"體積比表示，最終得出的流動相組成不同。也就是說，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計算的單純平均值不相同，所以用上述兩種方法調制的流動相組成差異。如在室溫(25℃)附近水50mL和乙腈50mL混合時體積不是100mL，而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡便的第一種方法。

28、流動相的配制注意溶劑體積的溫度影響

溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷藏箱拿出來的溶液溫度與實驗室的室溫相比，要低不少，乙腈和水混合液因發熱反應，溶液溫度升高。因此為能調制再現性好的流動相，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調到接近室溫。

29、流動相的配制注意用兩臺泵進行溶劑混合

雙泵主要是在探討流動相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時，建議配好后使用的話，混合比較均勻效果較好。在反相分析中，常用的有機溶劑和水的等濃度法，使用高壓兩元梯度系統，用兩臺泵將流動相分別輸液后混合等封閉式混合時與預先在瓶內混合后用1臺泵輸液時，因混合后體積變化的不同，保留時間也有所不同，一定要注意。不僅是流動性的調制方法，試樣溶液和其他溶液的調制也經常有上述問題。在這種情況下，就要求各部門在制作相關溶液配制方法時能規定通則，定義設計溶液的調制方法，這樣避免混亂，以在日常工作中更好地記住這些表示方法。

30、注意流動相的pH

如需在一定PH值下操作，須定期測定流動相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動相內將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴時這種影響可能更大。

31、注意更換柱子及流動相

軟質或半軟質填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時應先用25-30倍柱容積的合適流動相平衡。更換流動相時，如果兩種流動相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動相逐步溶解除去。如2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標準物保留值達到穩定狀態。