起源于上世紀60年代末的高效液相色譜技術（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，建立在經典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，開始了高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測器各技術不斷進步的旅程。其以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。

該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術應用。

解析真實世界的奧秘幾乎都要用到分離技術，有機物構成了物質世界的絕大部分，而超過80%的有機物，大都采用HPLC進行分離和分析。因此，液相色譜構成了科學儀器領域極大的單品類，其市場之大讓許多企業魂牽夢縈，無數企業前赴后繼地進入液相色譜市場。

誕生與發展

1903年，俄國植物學家Tswett在會議上報道了應用吸附原理分離植物色素的新方法（后來文獻發表于1906年），Tswett將這種方法命名為色譜（Chromatography），管內填充物被稱之為固定相，沖洗劑被稱之為流動相。

1941年，Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙酰基氨基酸，與Synge一同提出著名的色譜塔板理論，兩人獲得了1952年的Nobel獎。液固色譜被創立后的50多年時間里，液固色譜裝置并無實質性的改進；直到20世紀60年代，為了分離蛋白質、核酸等不易汽化的大分子物質，人們把氣相色譜中獲得的系統理論與實踐經驗應用于液相色譜研究。

1966年，耶魯大學的Horvath首次提出高效液相色譜（HPLC）這個名稱，后于1967年開發了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了HPLC的時代。1972-1974年，6000 psi泵、10μm粒徑色譜柱和無隔墊進樣器的引入，標志著HPLC從“高壓”向“高效”的轉變。液相色譜與光學檢測器相結合，也使HPLC不僅可分離，還可同時完成分析任務，成就一套分離分析系統。

1973年，第一屆HPLC會議在瑞士因特拉肯舉行，1982年后每年舉辦。20世紀70年代末至80年代初，HPLC開發了分離肽和蛋白質的方法，為今日蛋白質組學和生物制藥分析奠定了基礎。

1979年至80年代初，開發了用HPLC分離對映體的方法，最初采用在流動相中加入修飾劑，后來開發了可分離對映體的固定相。20世紀80年代中后期，John Fenn開發了ESI離子源，成功用于LC-MS。

2004年前后，引入< 2μm粒徑的新系統，推動耐壓15,000-20,000psi的UHPLC的出現。

商用發展史

1、色譜柱技術

色譜柱技術是儀器開發的主要驅動因素之一。

1967年，耶魯大學的Csaba Horváth和同事們在薄層填料（現稱為表面多孔填料，SPP）方面的工作代表了HPLC柱和儀器技術的突破。50微米的球形玻璃珠涂有一層薄薄的聚苯乙烯樹脂聚合物層（1-3μm），衍生形成陰離子交換功能，并用于分離核苷酸。顆粒被裝入不銹鋼柱（內徑1mm，長度3米），這會產生高背壓，需要使用泵將溶劑推過柱。這代表一個開始的趨勢，即較小的顆粒會提高柱效，以提供更好的分離性能，同時也會增加柱背壓，使其與平均顆粒直徑成反比；因此，在接下來的幾年里，泵輸出壓力將成為一個重要因素。除此之外，流速、額外柱效應（系統死體積）、峰寬減小、洗脫速度、樣品通量和檢測器能力等參數都成為改善HPLC系統所有部分的驅動因素。

2、第一臺HPLC的誕生

經過色譜柱技術的發展，他們自制了梯度洗脫系統，使用兩臺 Milton Roy 微型泵。梯度由一個含有弱溶劑的攪拌儲液池開始形成；然后由一個泵向該儲液池輸送受控但不斷增加的強溶劑量；第二臺高壓泵將越來越濃的溶劑混合物從儲液池推到色譜柱上；用一個帶有8μL流動池的改良分光光度計檢測。

1967年，他們與Picker Nuclear公司合作，推出第一臺商用HPLC：LCS-1000。一個高壓泵（高達4000psi）、一個進樣Loop閥、一個柱溫箱、裝有上述薄層填料的色譜柱，以及一個基于低壓汞蒸氣燈的固定波長檢測器（254 nm）成就了LCS-1000。1968年，該技術被Varian 公司收購（Varian后被安捷倫收購）。

同年，Waters推出首臺HPLC系統ALC-100（ALC是分析液相色譜儀的首字母縮寫），它改進了原有GPC-100系統，減少死體積，采用更高壓力的Milton Roy泵，流通紫外檢測器和（可選）和折射率（RI）檢測器。Waters將其品牌口號“Ther Liquid Chromatography People“注冊成商標，成為了LC的代名詞。1972年，在Robert B.Woodward 及其博士后Helmut Hamberger的指引下，分離維生素B-12合成過程中中間體的異構體；從此HPLC打開了有機合成的市場。

色譜學家傾向于將HPLC的起源推至更早期的1964年。

杜邦公司的Jack Kirkland在參觀Eidhoven理工大學時，在一間實驗室里看到Josef F. K. Huber已在自制粗糙的HPLC儀器，帶有紫外檢測器，在GC顆粒上包裹液體（和流動相不混溶）后填充了色譜柱。參觀后，Kirkland說服杜邦公司的經理讓他研制HPLC，進行GC無法全部勝任的農藥分離。

到1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀，有一個恒壓泵、一個自制的UV 254 nm檢測器（410型）和ZIPAX SPP色譜柱。并推出了第一批化學鍵合相，徹底改變了梯度HPLC的實踐。島津公司于同年開發出GPC系統，并于1972年與杜邦簽訂許可合同后開始制造銷售LC-1（LC-830），1978年推出自主研制的LC-3A，以CDQR方式的單柱塞型送液單元為特征。

3、進樣閥的演變

當杜邦和Waters將新的SPP填料（37-50μm粒徑范圍）裝入標準柱（內徑2.1 mm，長度50或100 cm）時，背壓適中，因此第一臺商用液相色譜儀采用了在線GC隔墊進樣器。

隨著填料顆粒變小，隔墊進樣器的耐壓能力不足，促使停流（stop-flow）技術的出現。這種手動進樣很麻煩，限制了樣品的通量，因此Valco的創始人Stan Stearns調整了GC閥，使進樣壓力達到4500 psi。六通進樣閥在生產率和重現性方面取得了真正的突破，并通過改變樣品Loop定量環尺寸，使進樣體積更靈活，還促進了后來進樣器的自動化。

Waters在其集成LC系列中使用了六通進樣閥后，1973年推出了自己的U6K進樣器，可進行方便、可變體積和可靠的進樣，并可實現自動化。該進樣器還具有一個創新的旁路通道，可在閥門循環時降低壓力沖擊，從而保護色譜柱在重復進樣后不會損壞。

后來，Rheodyne公司于1976年推出7125型進樣閥，對Valco方法進行了改進，使進樣器將樣品注射入閥的中心，可使用單個Loop環實現可變的進樣量。

4、模塊的崛起

早期的許多色譜用戶認為，每個制造商各有優勢，因而希望將最好的泵與最好的進樣器、最好的檢測器等結合起來，目的是構建一個具有快速可互換（或可升級）模塊的高級系統。為了滿足這樣的需求，一些制造商（尤其是OEM行業的制造商）決定開發可優化性能的獨立模塊。

其中第一家是實驗室數據控制公司（Laboratory Data Control，LDC），該司還利用EmmettWatson的服務構建價格合理的獨立模塊，包括254 nm紫外檢測器。該檢測器成為多家色譜公司的主要OEM組件。規模更大的Milton Roy公司收購了LDC，并成為許多HPLC公司和個人色譜儀的模塊供應商。Valco和Rheodyne等零部件公司專門生產注射閥（進樣閥）和切換閥。Schoefel、Cecil Instruments和Pye Unicam等檢測器公司開發了專門的探測器。許多較小的公司開發了其他外圍設備，可以根據需要快速更換。

5、液相泵的發展

Waters緊隨模塊潮流，開發了一款名為M-6000的獨立泵，這是第一款專門為HPLC開發的泵。M-6000使用了兩個往復式活塞，以便更平穩地流向色譜柱。其6000 psi的額定壓力足以滿足20世紀70年代初引進的25 cm柱（內徑4.6mm）中10微米粒徑填料的要求。

Altex（后被貝克曼收購）開發了全新概念的泵，使用可變活塞速度和快速再充滿（refill），由此產生的110型泵的流量比當時大多數低成本的往復式泵都要平穩。為了提供更高的壓力和非脈動流量，瓦里安（后被安捷倫收購）、Isco和Nester-Faust（后被珀金埃爾默收購）選擇開發注射泵。

在這里，大容量（250毫升）活塞由精確的步進電機驅動。這些泵基本上沒有脈沖，可以耐受高達6000 psi的高壓，后來達到8500 psi。對于二元梯度，需要兩個注射泵。但由于溶劑體積可壓縮性，色譜柱在梯度洗脫過程中遇到問題；進入混合器的每種溶劑的實際流量與控制器上的編程不同，這會產生成分錯誤——尤其是當每臺泵的啟動體積不同時。注射器泵雖然獨特新穎，但最終消失了。然而，注射泵值得一提，因為這項新技術試圖在提供無脈沖高壓流量時跳出框框思維。

6、工業3.0時代

在20世紀60年代末和70年代初，主要的數據輸出靠條形圖記錄儀。對于定量，通常采用手動方法，如切割和稱重圖紙或使用機械求積儀。Autolab改變了這一切，后來是SpectraPhysics（后被賽默飛收購又賣出，現屬Newport）的一個部門，它推出了System IV計算積分器，提供數字讀數。輸出可以表示為簡單的面積百分比或基于方法中存儲的校準因子。由于其較大的動態范圍，色譜儀不再需要在調整信號衰減的同時進行多次進樣，從而提高了實驗室生產率。

由微處理器控制的惠普HP 3380A積分器更進一步，它既是記錄器又是字母數字打印機繪圖儀，因此所有信息都在一張圖表紙上。此后，許多制造商推出了自己的數據系統來補充HPLC硬件。1979年，Nelson Analytical開發了基于個人電腦的數據分析軟件，利用新的大規模集成電路（LSI）構建模數轉換器，并提供具有強大計算能力的儀器控制和數據采集，成為許多制造商系統中的標準。

在20世紀70年代中期，高效液相色譜法越來越多地被用于制藥和其它行業，用戶每天需要分析許多樣品。第一臺進入市場的HPLC自動進樣器來自Micromeritics公司，這是一家專門從事粒度測量的公司，他們于1974年推出708A型LC自動進樣器，使用旋轉托盤中的管狀小瓶。將一根針放入小瓶中，刺穿瓶蓋，同時一個套環將瓶蓋向下推入小瓶，將樣品送入進樣環中。該系統可對小瓶中進行1-3次取樣。到20世紀70年代末，大多數主要供應商都推出了自己的自動進樣器。

7、集成液相系統的回歸

隨著HPLC被廣泛接受，儀器外圍設備的中央控制更有意義。模塊式LC概念正在失去支持，對于分析含有多種成分的樣品，梯度洗脫是必須的。產生二元梯度的雙泵系統（兩個泵在高壓側垂直連接在一起，需要一個混合器）產生。

惠普的分析部門（現為安捷倫科技）改進了兩年前收購的Hupe-Busch系統。HP 1084是第一款微處理器控制的LC，具有獨特的流量控制功能，并配有自動進樣器、紫外檢測器和外部熒光檢測器。1084的精確流量控制是很好的賣點，并具有高度可重復的保留時間。

由于兩個泵產生梯度系統的成本很高，因此，使用兩個或三個比例閥，可以生成二元或三元梯度，在方法開發過程中提供更大的靈活性。低壓梯度最終成為許多公司的標準，后來還開發了更強大的四元泵。1978年，瓦里安推出的LC-5000是第一款集成的高效液相色譜系統，它將低壓單泵梯度功能、關鍵功能的微處理器控制、用于設置方法的鍵盤和CRT顯示器集成在一個單元中。主動式進樣止回閥解決了止回閥粘性和注入損失的問題。1979年Spectra Physical推出的 Model 8000采用的設計與當今儀器中使用的溶劑混合設計幾乎相同。

1975年，Dionex（后被賽默飛收購）作為DurrumInstruments的一個部門成立，以應對一個新興的色譜市場：離子色譜（IC）。Dionex很快成為分離無機和有機離子化合物的領導者。他們的專利由陶氏化學公司授權，包括：使用離子抑制器從流動相中去除鹽，對分離的離子進行電導檢測。Dionex還開發了專門的IC柱，用于嚴格分離如飲用水中的痕量溴酸鹽和鹵代氧化物，使用脈沖安培檢測器進行碳水化合物分離，以及離子排斥分離。

8、多種色譜檢測器的問世

HPLC的前10年，光譜檢測器占主導地位。采用DAD光電二極管陣列檢測器后，可進行實時光譜測量，并可以實時獲得完整的紫外-可見光譜，后成為行業標準。1977年，惠普推出了全球第一個DAD檢測器8450，為此后的DAD檢測器設定了黃金標準。隨著GC-MS的巨大成功，各種液相色譜的接口類型被開發出來，以結合兩種顯然不兼容的技術——一種在液體環境中，另一種在真空中。接口技術包括直接液體接口、傳輸設備、粒子束、連續流FAB、離子噴霧和熱噴霧。

第一個成功的LC-MS接口，使用的不是移動的金屬絲，而是移動的傳送帶，可以傳輸更多的樣本，以獲得更好的靈敏度。1987年，Vestec公司推出熱噴霧接口，熱噴霧是20世紀90年代之前使用最多的LC-MS接口。

耶魯大學的約翰?芬恩（John Fenn）開發了ESI電噴霧，可產生完整、高分子量、多重質子化或去質子化的離子。Jack Henion及其同事發了一種離子噴霧接口，使用霧化氮氣輔助電噴霧操作；SCIEX（隸屬于丹納赫）使用了Henion專利，1989年推出第一款ESI類型的LC-MS接口。ESI現在是標準的LC-MS接口。

HPLC還發展了其它通用探測器。蒸發光散射檢測器（ELSD）和帶電氣溶膠檢測器（CAD）均將LC流動相流出物霧化成液滴，蒸發后留下非揮發性分析物的小顆粒。總的來說，2005年ESA Biosciences（先被Dionex收購，現隸屬于賽默飛）推出的CAD檢測器比ELSD更靈敏，并更利于梯度。CAD還可以檢測所有非揮發性和許多半揮發性分析物，且響應一致。

9、超高效時代

20世紀80-90年代的大部分時間里，液相色譜儀大都使用3-3.5μm或5μm顆粒、6000 psi泵和4.6 mm內徑的色譜柱。

為了滿足快速分析的需要，研究者開發了亞2μm尺寸的填料，系統再次被推向更高的工作壓力；而且由此產生的粘性加熱效應需要更窄內徑的色譜柱，因此還需要顯著減少額外的色譜柱體積。2004年，Waters推出Acquity UPLC系統，滿足了21世紀初新的小顆粒短柱（5-15 cm）和更窄孔徑（內徑2.0–2.1mm）的需求。Acquity對現有產品/技術進行了深思熟慮的組合，從而形成了一個具有合理低額外柱體積的實用系統。這項創新激勵其它十幾家公司推出類似的UHPLC產品。

10、其它創新

氣泡讓早期HPLC用戶很煩惱，流動相中的氣泡會損害主泵，檢測器的流動池中也會有氣泡。溶劑需脫氣，首先將溶劑煮沸，再通過精心設計的儲層將氣體擋在外面。后來SpectraPhysics發現儲液罐中的氦噴射阻止了空氣在溶劑中的溶解，并允許低壓混合有效地用于HPLC泵。再后來，膜脫氣器取代了氦氣噴射，成為今天所有HPLC/UHPLC的一部分。

Fittings（色譜接頭）也令人頭疼。通常情況下，過度擰緊配件會導致潛在泄漏，并在重新連接時表現不佳；來自不同公司的Fittings不兼容會產生死體積。Upchurch Scientific發明了手緊型接頭（Fingertight fittings），易于重復使用，并耐受非常高的壓力。

HPLC的出現不過三十多年的時間，但這種分離分析技術的發展十分迅猛，應用十分廣泛。其儀器結構和流程多種多樣。典型的高效液相色譜儀結構和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。

高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除銹劑的分析等物質的分析。